COURS et TD

- PCR et Clonage : enzymes de restriction, PCR (classique et quantitative), ligation, clonage par restriction et nouvelles technologies (Gateway, Gibson assembly), purification d’ADN (mini-préparation d’ADN) et vérification d’un clonage
- Purification de protéines, natives et étiquetées, par différentes méthodes chromatographiques : chromatographie par échange ionique, chromatographie d’affinité et chromatographie par exclusion moléculaire. Utilisation des résines de chromatographie d’affinité pour « pull down » et immuno/co-immunoprécipitation.
- Séparation de protéines et d'acides nucléiques par électrophorèse
- Centrifugation : centrifugation différentielle et centrifugations sur gradient de densité et leurs application lors du fractionnement cellulaire.
-Enzymologie : -Energétique des réactions, particularités du catalyseur enzymatique, coenzymes, cofacteurs. Cinétique michaelienne : équation de Michaelis-Menten, représentations graphiques, détermination des constantes Km, Vmax, kcat; facteurs affectant la vitesse d'une réaction (température, pH, inhibiteurs); activités enzymatiques, bilan de purification
 

Les CM et les TD apportent à l’étudiant les connaissances nécessaires pour acquérir les compétences suivantes:

• Bases théoriques pour effectuer un clonage en vue de la surexpression d’une protéine recombinante ayant une étiquette. Choix des oligonucléotides pour amplifier la séquence codante et pour le clonage en phase de lecture avec l’étiquette ; ligation ; transformation ; sélection du « bon » plasmide.
• Comprendre les techniques de base pour la purification et analyse d’une protéine recombinante.
• Bases théoriques pour la caractérisation, par étude cinétique, d’une enzyme.